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抗炎免疫藥理實驗方法學的某些進展

時間:2014-10-02 15:25:19  來源:  作者:李 俊; 徐叔云

抗炎免疫藥理學是藥理學一門新的分支學科,其主要研究的目的是探討抗炎免疫藥物的作用,作用機制及作用的規律性,尋找防治炎癥免疫功能紊亂性疾病的有效藥物,從而有助于揭示炎癥免疫功能紊亂性疾病的病因和病理機制。隨著免疫學、分子生物學、病理學等相關學科的迅速發展,抗炎免疫藥理學領域的研究十分活躍,涉及面很廣,研究內容越來越豐富,而多學科的相互滲透,使抗炎免疫藥理實驗方法學有了較大的進展,這無疑對抗炎免疫藥理學的發展起了積極的推動作用。為此本文從整體動物模型和細胞分子水平兩個方面,就近年來該領域的實驗方法學中的某些主要進展作如下綜述。

 1 關節炎動物模型

大鼠佐劑性關節炎(adjuvant arthritis)模型是一種T細胞介導的自身免疫性疾病模型,是研究抗炎免疫藥物及治療人類風濕性關節炎藥物的理想的動物模型,巳普遍受到人們的重視。季紅等實驗提示,AA免疫反應高峰期脊髓背角及背根神經節SP含量增多,耗竭脊髓背角SP,細胞免疫功能更為亢進,AA病情加重,人為增加脊髓背角SP含量,AA大鼠免疫水平降低。推測AA大鼠免疫反應的同時也刺激了含SP的感覺神經末梢,使脊髓背角SP含量增多,通過未知通路向高級中樞神經傳遞信息,整合后產生某種反饋抑制,作用于免疫系統,使之不致于反應過強,而起到一定的自身保護作用。提示免疫調節肽SP,特別是脊髓背角SP參與AA鼠免疫系統的調節。為從神經免疫調節探討AA以及多種自身免疫性疾病的發病機理,開發新型抗炎免疫藥物提供了新思路。 重型膠原關節炎(collagentype重induced arthritis,CII A)是Trentham等1977年首次建立的實驗性關節炎模型.1980年代至90年代初期,國外大量重復,并在臨床表現、病理組織學和免疫學等方面進行了廣泛、深入的研究,使其不斷成熟和完善。雞、小牛、大鼠的重型膠原均能引起關節炎。一般可在嚙齒類動物和靈長類動物中產生.本所先后用小鼠、大鼠成功地建立了C II A模型。C II A與AA有許多相似之處,但在免疫指標上也有不同。CⅡA的免疫功能變化兼有體液免疫和細胞免疫,動物體內存在針對自身CII的高滴度IgG抗體,這些特性更接近人的類風濕性關節炎,因治此是篩選和研究治療類風濕性關節炎藥物的理想模型,也為今后研究人類與自身免疫有關的疾病提供了一個極有價值的實驗模型。

2 系統性紅斑狼瘡動物模型

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種病因未明,累及多個系統,病程遷延反復的自身免疫性疾病。多年來,理想的動物模型的缺乏一直是影響SLE研究的主要原因。自六十年代起,國內外學者逐漸建立一系列SLE病理模型,包括自發性和實驗性兩類:

(1)自發性模型:主要包括三種品系小鼠:NZB/NZWFl(B/W)、MRL/MP-lpr(MRL-lpr)和BXSB。NZB/NZWFl小鼠是NZB與NZW小鼠的雜交子代,可自發性出現免疫異常,主要表現為,T、B細胞的過早發育與成熟,B細胞多克隆激活,抗核抗體出現及免疫復合物性腎炎.MRL-Lpr小鼠的基因組合75%來自LG,13%采自AKR,12%為C3H,0.3%為C57BL/6,H-2單倍型為H-2K。該鼠能自發性形成免疫復合物性腎炎,血清中有大量的抗核抗體,淋巴組織高度增生。而BXSB小鼠是(C57BL/6 JXSB/Le)F1,其H-2單倍型為H-2b,可出現T、B細胞異常增生,胸腺萎縮,亦可產生大量自身抗體及免疫復合性腎炎,后期可并發嚴重關節炎。這些小鼠的共同特征是自發性出現一些類似于人SLE的癥狀及免疫學異常,T細胞亞群在免疫功能紊亂中起重要作用。但這些模型發病較晚、周期長,不易控制實驗過程。

(2)實驗誘導SLE動物模型:主要包括同種異體淋巴細胞誘導的小鼠SLE模型,空腸彎曲菌誘導的小鼠SLE模型、pristerne誘導小鼠SLE模型以及肽類及人抗DNA獨特抗體誘導的SLE模型。這些模型共同的特點是:自身抗體出現較早,一般在再次免疫1~4周內,1~2月內基本出現免疫復合物性腎炎等多器官慢性炎癥表現,實驗方法相對簡單,而各模型各有特色。盡管上述模型與人類SLE還存在不少差距,但多種模型相互結合,為從不同側面研究SLE的病理機制提供新途徑。本所周玲玲分別采用空腸彎曲苗CJ-S131和Pristane成功地建立SLE小鼠模型,并初步探討了免疫調節藥白芍總甙和褪黑素對SLE小鼠的雙向免疫調節作用。

3 免疫性肝損傷模型

目前對肝臟疾病的病理過程仍缺乏足夠的認識。但肝內免疫反應巳被公認為造成肝損傷的重要機制之一。朱凡凡采用刀豆蛋白A(ConA)和2'-去氧鳥苷改變小鼠免疫狀態,再用同系小鼠肝細胞膜特異性脂蛋白(LSP)免疫小鼠,誘導小鼠自身免疫性肝炎模型。我所陳學廣等采用異品系小鼠LSP并在免疫LSP的同時輔以弗氏完全佐劑(FCA),使血清SGPT和LSP抗體滴度顯著升高。近年來,先后建立了用異種血清,包括豬、牛、馬血清,異體蛋白,包括豬白蛋白、血清球蛋白、人丙種球蛋白、人血白蛋白,BCG+LPS注射制作免疫肝纖維化病理模型。本所許建明采用短小棒狀桿菌+LPS序貫靜脈注射建立免疫性肝損傷,該模型發病快,血SGPT在造模后16-18 h達高峰水平,并伴肝脾明顯腫大,血漿NO水平升高和脾細胞致分裂素反應明顯下降的特點。為模擬臨床肝炎的細胞免疫病理過程,徐強等采用1%Picryl chloriele(Pcl)乙醇溶液腹部涂藥致敏,再用0.2%~0.5%Pcl的橄欖油溶液肝穿刺攻擊,18h后模型組血清轉氨酶顯著上升,肝組織壞死,炎性細胞浸潤,甚至浸及整個肝臟。上述模型的建立,為肝損傷的機制及藥效評價開辟了新的途徑,但仍與病毒性肝炎免疫損傷所致的纖維化模型有相當大的差異。尋找新的、在免疫及病理學等方面相比更接近臨床肝炎的動物模型仍是今后人們努力的方向。

4 艾滋病動物模型

艾滋病(AIDS)是20世紀人類的頭號病魔。尋找合適的動物模型一直是AIDS研究的重大難題之一。理想的AIDS動物模型應是:能感染HIV; 動物體型小;遺傳、免疫、代謝特性較清楚,靶細胞應該是CD4+淋巴細胞和巨噬細胞為主。靶器官應包括血清、淋巴組織和腦,傳染方式應類似HIV,發病癥狀與人AIDS相似。但至今尚未發現理想的動物模型。近年來,有關艾滋病動物模型的研究取得了一些進展。常用的評價艾滋病治療藥物的鼠模型主要有;

(1)鼠白血病病毒模型 鼠白血病病毒(Murine leukernia virus,MULV)屬于反轉錄病毒,接種于敏感鼠后可以導致脾淋巴結增大,免疫抑制和機會性感染等癥狀,稱為鼠艾滋病 (MAIDs).該模型也被用于研究和評價AIDS的治療藥物以及免疫調節劑。

(2)嵌合鼠模型 利用嚴重聯合免疫缺陷小鼠(SCID)缺乏功能性T、B細胞,而不發生異體移植排斥反應的特性,將胚胎組織或末梢血細胞移植給SCID,從而建立嵌合型鼠模型。其特點是對多種病人血液中HIV-1分離株和實驗室HIV-1株敏感。 MAIDs模型具有易建立、重復性好、安全周期短,不需特殊實驗,不造成生物災害等特點,作為篩選抗反轉錄病毒藥物和免疫調節劑的模型具有明顯的優勢,但MULV雖攜帶反轉錄病毒所具有gag、pol、env等共同基因,沒有HIV-1所特有的nef等調節基因。所以MULV/MAIDs系統只能用于評價那些作用于反轉錄病毒共同基因的藥物。而SCID/HIV-1模型系統尚處于建立時期,操作復雜、病毒在體內復制過程和病理生理變化尚不清楚,但它畢竟是HIV-1感染的小動物模型,具有MULV/MAIDs系統不可比擬的優勢,是一種很有希望的小動物模型。

5 早老性癡呆

早老性癡呆(Alzheimer's disease,AD)是一種與年齡相關的、進行性神經退化而導致癡呆的疾病。流行病學研究發現,使用抗炎藥物的人群AD發病率,癥狀及持續時間均明顯低于、輕于對照人群。近年來許多資料表明,炎癥免疫機制在AD的發生發展中起重要作用。尤其是通過中樞小膠質細胞的激活,釋放IL-1及IL-6等炎癥細胞因子,促進腦內淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor peptide,APP)變為淀粉樣蛋白β(amyloid β-peptide)及老年斑(senile plaques,SPS)的形成,使神經纖維纏結,突觸減少和神經元喪失。此外,細胞凋亡、氧化應激、tau過度磷酸化等均可能是AD的發病機制。由于對AD發病機理尚缺乏根本的了解,因此尚缺乏真正的AD模型。目前常采用的主要有:1)AICl3渭胃,建立大鼠老年性癡呆模型,主要病理變化為在癡呆大鼠背海馬結構各部位可見較多的β-AP樣免疫反應神經元和較強β-APP表達:2)毀損Wistar大鼠邁內特基底核(nucleus basalis of Meynert,nbM)建立AD動物模型,其表現為記憶力下降,乙酰膽堿酯酶(AchE)銳減,β-AP和tau蛋白樣免疫神經元增加、變性、壞死細胞形成,并有人AD相似的老年斑,3)采用海馬內微量注射β-AP多肽誘發AD模型,注射一周,學習記憶發生改變,出現大量膠質細胞反應,神經原軸突退化。此外,還有鵝育覃氨酸基底前腦注射致膽堿能損傷大鼠,雙側頸總脈永久性結扎致腦缺血大鼠和D-半乳糖皮下注射后自由基增多致腦老化小鼠等。自1995年以來,發達國家巳用基因技術培育出早老性癡呆動物模型,國內已有單位引進日本快速老化小鼠(Senencence accelerated mouse,SAM)模型,但上述模型并不具備AD的全部特征,具有一定局限性。因此,采用不同模型,多方面著手,仍是研究該類藥物的主要途徑。

6 移植免疫 同種異體器官移植能導致受體動物產生排異反應。這種反應能被免疫抑制劑抑制或延緩,在動物實驗中,多種器官可以進行異體移植,如皮膚片、腎、心臟、小腸、肝等,可通過免疫抑制對捧異反應的抑制程度來評價免疫抑制性藥物。一般通過用藥組和對照組的排異時間平均值來評價免疫抑制的作用強度.隨著我國器官移植外科學的發展,器官移植手術在我國較大醫院巳相當普及。相對來說,移植免疫的動物模型研究相對滯后,研究開發免疫抑制藥物對移植免疫動物模型的影響相對較少,因此開展藥物對器官移植免疫動物模型機理的研究,對提高我國移植外科醫生的臨床用藥水平,發展我國自巳的免疫抑制藥物,尤其從中草藥中開發新型的免疫抑制具有重要的理論和現實意義。

7 神經免疫功能紊亂 疾病的動物模型 近年來研究發現,神經系統部分疾病的發病機制和免疫功能紊亂有關。巳明確中樞神經脫髓鞘引起多發性硬化(multiple sclerosis,MS)及周圍神經脫髓鞘病格林-巴利綜合癥(GBS)等疾病與免疫功能有關。其中MS是以堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein,MBP)為自身抗原,GBP則以周圍神經髓鞘中P。蛋白為重要的抗原。實驗性變態反應性腦脊髓膜炎和實驗性變態反應性神經炎模型是人們研究神經免疫性疾病的常用模型。

(1)實驗性變態反應性腦脊髓膜炎(EAE)是研究MS的理想動物模型.其發病機理,臨床體征及病理組織改變和MS相似,因此被廣泛用于研究MS的發病機理和藥物治療作用的研究,而且近年來有重要的突破。多數學者認為,MS是一中樞神經系統的自身免疫性疾病,是體內CD4細胞對自身抗原一種免疫反應,主要的自身抗原包括MBP或MBP的多肽片段、含脂蛋白(proteinlipid protein,PLP)等在動物小鼠、大鼠及豚鼠均能誘發成功。采用牛MBP致敏SJL小鼠建立實驗性變態反應性腦脊髓模型,分離EAE發病動物外周血對CD4特異的T淋巴細胞,用此種細胞靜脈注入同種健康小鼠,可建立被動轉移EAE模型。該模型可以更直接地用于研究EAE和MS的發病機理,及藥物預防和治療機理的研究。

(2)實驗性變態反應性神經炎模型(EAN)采用牛MBPP2蛋白加弗氏不完全佐劑,多點基礎免疫7d后,同劑量加強免疫一次,一周后動物發病。主要動物為Lewis大鼠或兔。其主要表現為:精神萎靡、體重下降,先出現雙下肢無力,逐漸加重到癱瘓,隨之發展到四肢癱瘓、四肢針刺反應減退。此種動物模型的發病機理、臨床體征及組織病理與人類格林巴利綜合征(GBS)相似,因此,EAN作為GBS的動物模型巳被國際所公認并廣為應用。

8 粘膜耐受實驗研究方法 粘膜耐受(MT)是指粘膜通過口服或鼻腔吸入等途徑接觸蛋白質抗原后,再用此種蛋白進行粘膜外免疫,引起的一種系統低反應狀態。1911年Wells首次用公雞卵白蛋白喂豚鼠,發現豚鼠對此種蛋白質引起的過敏具有抵抗性,Chase用二硝基氯苯喂豚鼠,發現豚鼠對二硝基氯苯的皮膚反應性降低。八十年代,口服耐受才應用到炎癥免疫性疾病動物模型的治療上.此外,研究發現,鼻腔給予蛋白也是一種有效誘導免疫耐受的研究的方法。 粘膜耐受的機制較為復雜。一般認為小劑量抗原口服后,通過調節性T細胞分泌一些抑制性細胞因子如TGF-β、IL-4、IL-10等,介導導主動抑制,大劑量口服或吸入后,抗原通過作用胸腺、脾臟及粘膜局部伴發的淋巴組織等處的Thl、Th2細胞,使其克隆無能(cloneanergy)或克隆清除(clonedeletion)發揮免疫耐受作用。目前,通過口服Ⅱ型膠原可以明顯抑制由Ⅱ型膠原誘導的大鼠或小鼠的關節炎;口服MBP、可以對MBP誘導Lewis大鼠和SJL小鼠的EAE發揮明顯治療作用,通過口服耐受治療其他免疫功能紊亂性疾病的研究正在國內外許多實驗室進行,而且走在逐步應用臨床。因此,MT的研究,對于炎癥免疫性疾病的治療提供了新的思路。

9 結語

炎癥與免疫是機體的兩種不同功能,但又密切相關不可分割,其相互之間的關系,錯縱復雜。抗炎免疫藥理學主要研究藥物對炎癥和免疫功能的作用及其機制,為炎癥免疫性疾病的藥物治療提供理論基礎。實踐證明,多數抗炎免疫藥物在發揮抗炎作用的同時,又影響機體的免疫功能,使機體異常的免疫狀態(升高或降低)恢復,(而對正常的免疫功能無明顯影響;抗炎免疫藥物多作用于炎癥免疫功能的不同環節,但離不開機體神經內分泌系統內環境的相互影響,且不同品種、性別年齡的動物對抗炎免疫藥物的反應可能不同.因此,在進行抗炎免疫藥理學研究時,應合理選擇不同的實驗方法,尤其注意要;

1)正常與病理動物模型相結合;

2)體內與體外實驗互相補充;

3)多種方法、多項指標綜合評價。

此外,還要注意選擇敏感的實驗動物。誠然,目前市場上出現相當多品種的抗炎免疫藥物,但其臨床應用效果遠沒有達到理想的水平。其主要原因是炎癥免疫調節網絡的復雜性,現行的抗炎免疫藥理方法尚難以確切地評價其療效。當今抗炎免疫藥理學的研究在生物醫學領域里,既是熱點所在,亦面臨著巨大的挑戰,相信在未來的發展中將會有新的突破。

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