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植物反應器生產口蹄疫疫苗的研究進展

時間:2014-10-01 16:37:12  來源:  作者:常惠蕓; 侯順利

口蹄疫(Foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一種烈性傳染病,主要感染偶蹄獸,患病動物的口、舌、唇、蹄、乳房等部位發生水皰,破潰形成爛斑。由于豬、牛、羊等主要家畜均可感染此病,并能形成規模流行,因而國際獸疫局(OIE)將該病列為A類家畜傳染病之首。 防制口蹄疫的方法大致有三種,一是嚴格檢疫及封鎖疫區;二是撲殺疫區內的病畜和易感動物,并進行徹底消毒;三是廣泛免疫預防。人工免疫常用的疫苗有弱毒疫苗和滅活疫苗兩種。弱毒疫苗有較好的免疫力,免疫持續時間長,疫苗接種量少,價格低廉。對FMD而言,盡管有多種弱毒疫苗,但效果都不夠理想。因為口蹄疫病毒弱毒疫苗的毒力常隨動物的種類不同而不同,如對牛毒力很低的疫苗株,可能對豬或羊仍然有致病力,而且同一種弱毒疫苗在同種動物的不同品種、不同年齡及不同生理狀態也常表現不同的毒力;弱毒疫苗中的活病毒在動物體內長期存在,一旦毒力增強,有可能對周圍的其他易感動物構成威脅。國際上已有多起由于使用弱毒疫苗而引起FMD暴發的報道。因此,許多國家已明文規定禁止使用弱毒疫苗。滅活疫苗克服了弱毒疫苗的一些弱點,在許多國家都收到了良好的預防效果,但其接種量較大,免疫持續時間相對較短;再加上疫苗制造過程中的一些人為原因,近年來國際上發生過多起FMD暴發的原因似與滅活疫苗中的殘留病毒或感染性核酸有關,在這種情況下促進了人們進行基因工程疫苗的研究。 近十幾年來,隨著生物技術特別是植物基因工程領域的研究進展,使人類獲得了操縱外源基因在植物中表達的能力。1992年Mason等率先提出了用植物反應器生產疫苗的新思路。此后,許多實驗室相繼在煙草、馬鈴薯、番茄、苜蓿和萵苣中表達了乙型肝炎表面抗原、大腸埃希氏菌熱不穩定腸毒素B亞基、霍亂毒素B亞基、諾瓦克病毒衣殼蛋白、呼吸道合胞病毒抗原和狂犬病毒G蛋白等抗原,并利用在植物中表達的動物和人的免疫試驗,獲得了大量有價值的研究數據,為今后利用植物反應器生產疫苗奠定了基礎。

 1 植物反應器生產疫苗的原理和方法 隨著生物技術的高速發展和植物細胞培養及再生方法的日益完善,人們不僅在改造植物本身的遺傳性狀及創造新品種方面取得了令人矚目的成就,而且在把植物作為新型的天然生物反應器(natural bioreactor)生產藥物、抗體、疫苗等有重要經濟價值的外源蛋白方面也取得了可喜的進展。利用轉基因植物生產疫苗,是將抗原基因導入植物,使其在植物中表達,人或動物攝取該植物或其中的蛋白質后,就可產生對某抗原的免疫應答。植物反應器生產疫苗主要包括以下過程:目的基因的獲得;植物表達載體的構建,即將抗原基因插入到植物表達載體(如pBIl21質粒)中;再通過直接法(基因槍法、電擊法等)或載體法(農桿菌介導法、脂質體介導法等)將含有目的基因的表達載體導入植物細胞,外源基因隨即整合入植物基因組中;選擇轉基因植物再生;表達水平的檢測。在獲得目的基因的整個過程中,植物遺傳轉化的受體系統、載體系統和遺傳轉化方法是植物反應器生產疫苗的關鍵技術。

1.1 植物遺傳轉化的受體系統及其特性

1.1.1 植物組織受體系統 受傷的細胞易受到病毒或質粒的感染。這些病毒或質粒上的某些DNA通過不同的方式轉移到受傷細胞中,并形成愈傷組織,用愈傷組織可以培養成完整的轉化植株。該受體系統轉化率高,可獲得較多的轉化植株,取材廣泛、適應性廣,但再生植株變異較大,轉化的外源基因穩定性差,嵌合體多。

1.1.2 植物細胞原生質體 是植物細胞除去細胞壁后的部分,是一個質膜包圍的"裸露細胞"。原生質體在合適的條件下具有分化、繁殖并生成完整植株的能力。原生質體在體外比較容易完成一系列細胞操作或遺傳操作,相互之間可以發生細胞融合,而且還可以直接高效地捕獲外源基因,缺點是嵌合體少,遺傳穩定性更差,培養周期長,難度大,再生頻率低。

1.1.3 生殖細胞受體系統 是以植物生殖細胞如花粉細胞、卵細胞為受體細胞進行基因轉化的系統。目前主要以兩個途徑利用生殖細胞進行基因轉化,一是利用組織培養技術進行花粉細胞和卵細胞的單倍體培養,誘導愈傷組織細胞,進一步分化發育成單倍體植株,從而建立單倍體的基因轉化系統;二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉化,如花粉管導入法、花粉粒浸泡法、子房微針注射法等。由于該受體系統具有更強的接受外源DNA的潛能,一旦將外源基因導入這些細胞,猶如正常的受精過程。利用植物自身的受粉過程,操作方法方便、簡單,不足之處是利用該受體系統進行轉化受季節的限制,只能在短暫的開花期進行,且無性繁殖的植物不能采用。

1.2 植物遺傳轉化的載體系統 作為植物遺傳轉化的載體必須是能進入宿主細胞內進行復制和表達的核酸分子。目前的載體系統有病毒的載體系統和質粒的載體系統兩大類。

1.2.1 病毒載體系統 植物病毒作為植物遺傳轉化的載體系統是由植物病毒的侵染特性所決定的。以病毒作載體的表達體系,統為瞬時表達系統,一般不能把外源基因整合到植物細胞基因組中。植物病毒的感染率很高,在較短時間內可獲得較大的表達量。但因以病毒為載體的表達系統每個宿主材料都要接種病毒載體,故瞬時表達系統不易起始。作為病毒載體的病毒最好是雙鏈DNA植物病毒。目前已有十幾種植物病毒被改造不同類型的外源蛋白表達載體,包括椰菜葉病毒(CaMV)、煙草花葉病毒(TMV)、虹豆花葉病毒(CPMV)和馬鈴薯X病毒(PVX)等,其中在TMV載體中成功表達的外源病毒至少有150種以上。

1.2.2 農桿菌載體系統 近年來,農桿菌一直是世界各國科學家研究的特點,與植物轉化有關的農桿菌有兩種類型:一種為根瘤農桿菌(Agrobacten'um tumefaciens)它含有丁i質粒,能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤,即誘發產生冠癭瘤(crown gan);另一種為發根農桿菌(A。rhizogenis),它含有Ri質粒,能誘導被侵染的植物細胞產生毛發狀根,形成莖癭瘤(cane pn)。Ti質粒(含凡質粒)上有一段轉移DNA(transfer DNA,又稱T-DNA)。在農桿菌侵染植物時,這段DNAR移是指T i或Ri)質粒上的DNA被加工、切割、復制、越過細菌膜進入植物細胞被整合到植物基因組的全過程。植物基因轉化必須有Ti質粒上T-DNA和Vir基因即毒性區兩部分的參與,T-DNA的邊界序列和Vir區域是T-DNA的轉移和整合到植物所不可缺少的。T-DNA的邊界序列在整合過程中邊界序列之間的T-DNA可以轉移并整合到宿主細胞基因組中,而邊界序列之間的T-DNA并不參與轉化過程,因而可以用外源基因將其替換。vir區大小為30kb,分為virA、B、C、D、E、G、H等7個操縱子,一共有24個基因共同控制著T-DNA的加工和轉移,它們總稱調控子。由于Vir基因在植物基因轉化中起著越過細胞膜進入植物細胞的作用,因此在建立載體時必須含有完整的Vir基因。此外,該載體含有T-DNA的邊界序列而且這個質粒還能在大腸埃希氏菌和農桿菌之間進行穿梭。目的基因在轉化酶的作用下與雙元載體連接后,轉化至大腸埃希氏菌中,大量增殖分離、純化并遷移到癌農桿菌中,然后在含有抗生素的選擇培養基上與相應的植物細胞共同培養,在癌農桿菌中目的基因整合到植物細胞染色體中,并隨同植物的遺傳而獲得穩定的遺傳性狀。

1.3 植物遺傳轉化方法 植物遺傳轉化方法可分為兩類。一類是載體介導的轉化,即利用另一種植物實現基因的轉入和整合。目前這種載體有質粒載體和病毒載體兩種,即通過機械接種感染植物的病毒載體轉化方法和通過農桿菌質粒介導的基因轉化方法。由于農桿菌質粒介導的基因轉化方法的穩定性、重復性好,設備簡單,操作方便,故應用廣泛。另一類轉化方法是基因直接轉化,不依賴農桿菌載體和其他生物媒體,將特殊處理的裸露DNA直接導入植物細胞實現基因轉化,因此也稱為無載體DNA介導轉化。其中基因槍法最常用,而且操作簡單、快速,缺點是轉化頻率低。

2 轉基因植物可食疫苗與黏膜免疫反應 可食疫苗能成功地誘導黏膜免疫反應(mucosal immune system,MIS)。黏膜免疫反應是人類和動物最初感染病原的最主要和有效的表面防衛系統,位于消化道、呼吸道、尿道、生殖道的表面。小腸淋巴組織黏膜M細胞可進行抗原識別而誘導黏膜免疫反應。M細胞把抗原傳遞到抗原呈遞細胞(APC),吞并加工抗原,這樣抗原表位被呈遞到抗原呈遞細胞表面,在輔助性T細胞的幫助下,激活B細胞。被激活的B細胞移動到腸系膜淋巴結,在此發育為成熟的血漿細胞,然后移動到黏膜分泌出IgA。在通過黏膜上皮層到細胞腔的過程中,IgA分子復雜化,與膜結合分泌因子形成分泌型IgA(SIgA),SIgA在細胞腔與特異性的抗原表位作用而中和入侵的抗原。一般來說,通過口服產生的黏膜免疫反應比通過注射產生的黏膜免疫反應效果好。與皮下注射免疫相比,使用亞單位或可溶性抗原口服免疫效果較好,而且需要的抗原量也少。

3 植物反應器生產口蹄疫疫苗的研究進展

3.1 Carrillo等將FMDV VPI基因轉化到擬南芥(Arabidopsls thaliana)中;用轉基因植物葉的提取物注射于小鼠,免疫動物對VPI區135~160合成肽、結構蛋白VPI和完整病毒粒子均可產生特異的抗體反應,免疫小鼠均對病毒攻擊產生保護。這是首次利用轉基因植物表達抗原引起動物產生抗病毒的免疫反應。

3.2 Wigdorovitz等將FMDV VPI(OIC)插入煙草表達載體中,用轉基因植物葉提取注射于小鼠,免疫小鼠均對病毒攻擊產生保護。

3.3 Wigdorovitz等還將FMDV VPI基因克隆到雙元植物表達載體中,在根瘤農桿菌的介導下轉化到苜蓿中,VPI基因在苜蓿中能有效表達。用轉基因植物葉的提取物注射小鼠和用新鮮葉直接飼喂小鼠均可產生抗病毒特異免疫反應,免疫動物對VPI區135~160合成肽、結構蛋白VPI和完整病毒,粒子均可產生特異的抗體反應,免疫小鼠可以耐受病毒攻擊。該試驗為利用轉基因植物生產動物口服疫苗提供了有力的支持。

3.4 Carrillo等將FMDV VPI插入馬鈴薯表達載體中,VPI基因在馬鈴薯中能有效表達。用轉基因馬鈴薯口服飼喂試驗動物,免疫動物能夠產生抗FMDV特異抗體,并耐受強毒攻擊。試驗證實,用植物反應器生產疫苗,可以避免抗原濃縮或純化的煩瑣步驟。作者在提高VPI基因在植物表達量的試驗中,采用花椰菜花葉病毒一元啟動子(pPok2)和雙元啟動子(pPok3)轉化馬鈴薯,結果無明顯差異。

3.5 我國利用轉基因植物生產口蹄疫疫苗的研究起步較晚。北京大學李毅教授已將FMDV結構蛋白VPI基因插入植物表達載體中轉化玉米,目前正在做檢測工作。中國農業科學院生物研究所、作物研究所和草原生態研究所利用大豆和馬鈴薯表達FMDV結構蛋白的研究工作也已啟動。 4 植物反應器生產疫苗的優缺點及評價

4.1 轉基因植物可食疫苗遺傳性狀的評價 可食疫苗植物是否獲得穩定的含外源蛋白基因的遺傳性狀,可通過檢測轉化植物中是否含有可表達的外源基因所表達的相應的產物來評估。可在轉化植物的各個階段進行檢測,及時淘汰未轉化的植株,為下一步轉化植物的篩選提供依據,如檢測轉化植物中是否存在外源基因和拷貝數的多少,可應用PCR和Southern雜交方法。植物反應器作為疫苗生產系統研究較多的是馬鈴薯,人用疫苗采用香蕉和番茄,其他植物各有其優缺點。

4.2 轉基因植物作為疫苗生產的生物反應器的優點 它為人類提供了一個安全和廉價的疫苗生產體系,與微生物發酵、動物細胞和轉基因動物等生產系統相比,它具有許多潛在的優勢:①植物細胞具有全能性,能夠再生植株,轉基因植物的種植不需要特殊技術和復雜的生產設備、設施,只要有陽光、養分和水,就可通過大面積栽培轉基因植株進行大規模生產,是最經濟有效的疫苗生產系統;而細菌在發酵過程中常產生一些不溶性聚合物,將這些聚合物重新溶解并折疊成天然蛋白質,需要很高的成本。并且部分轉基因疫苗可直接口服,既節省了提取、純化和保存成本,又免去煩瑣的接種程序,節省免疫器材和接種費用。②與動物細胞比較,植物培養條件簡單,便于遺傳操作,并可克服微生物系統不能對真核生物蛋白進行準確翻譯后加工和蛋白的糖基化,使三維空間結構更趨于自然狀態,表達產物具有與動物病毒抗原相似的免疫原性和生物活性。③常規疫苗和其他新技術疫苗在大規模培養過程中,很容易發生病原性細菌污染,特別是霉形體污染極其普遍,而轉基因植物疫苗不含致病微生物或潛在致病微生物,免除了使用活病原的風險和疫苗的滅菌問題,對人畜安全,不會引起負反應。④轉基因植物疫苗不需要特殊容器分裝,不需低溫保存和冷藏運輸。⑤轉基因植物疫苗在生產過程中不會對環境產生任何污染,還有綠化、美化環境的作用。⑥轉基因植物中外源基因可通過植物雜交的方法進行基因重組,進而生產一種方便、高效的多價口服疫苗。 4.3 植物反應器生產疫苗也存在一些問題 植物反應器生產的疫苗表達量不高,口服時易被消化,是否引起動物過敏和免疫耐受還須進一步研究。 利用轉基因植物生產疫苗,提供了口服疫苗最經濟有效的來源。從長遠觀點來看,植物將作為生產新型疫苗的反應器,在未來的疫苗和藥物生產中可能占一定地位。應用動物飼料如馬鈴薯、苜蓿、谷物類等植物表達的抗原飼喂動物,均可直接作為口服疫苗,這種僅靠飼喂某些草料就可預防某些傳染病的技術,相信在不久的將來定會成為現實。

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