養殖與種植專家-農業戶網
>您當前的位置:首頁 > 生物

新城疫病毒分子生物學最新研究進展

時間:2015-01-14 17:41:15  來源:  作者:王忠田; 王澤霖

隨著NDV分子生物學研究的日益深入,人們發現NDV不同毒株之間的免疫原性和毒力主要與其F蛋白和HN蛋白有著密切的關系。這就有必要對NDV的分子生物學水平進行全面系統的了解和研究。

1 NDV的分子生物學特征

1.1 NDV的基因組特征 NDV是一單鏈負股RNA病毒,其基因組長度約為15kb,分子量約為51-57kDa。病毒感染細胞后,基因組產生三組RNA,沉降系數分別為18S,22~28S和35S。35SRNA為一個單一的mRNA片段,編碼L蛋白。分子量為220kDa。18SmRNA含有基因組中所有剩余的獨特的mRNA,可分別能編碼M,HN,F,NP,P五種蛋白。Northern雜交證明,18S和35SmR-NA包含了所有的編碼區域,而28S包含了18SRNA的編碼區域,表明它可能是18S的共價連接產物。22SmRNA不含特異片段,但轉錄產物與18S相似,代表多順反子信息。病毒基因組有98.8%被轉錄成上述六種蛋白的mRNA,各基因組間有一個3'-GAA保守序列。NDV mRNA的轉錄是以A開始的,在各組mR-NA之前均有一個保守的起始信號3'-UGCCCAUCU-U-5'。且每一基因末端含有轉錄的終止信號序列,即3,-AUUCUUUUUU-5'序列和與mRNA互補的polyA。mRNA的起始信號和poly A之間的距離不等,通常在1-47個核苷酸之間。

1.2 NDV的結構蛋白特征 NDV有NP、P、M、F、HN、I六種病毒特異性結構蛋白。其中HN蛋白與F蛋白是重要的宿主保護性抗原。

1.2.1 F蛋白 F基因從其轉錄起始信號到PolyA 尾巴約有1 790個核苷酸。F基因有一個開放閱讀框D1。其轉錄的起始信號是ACGGTAGAA,在1 783、1 786位含有與真核生物相同的終止密碼子TA(A)G。病毒的F基因轉錄、翻譯成F蛋白。F蛋白由553個氨基酸組成,分子量為59.66kDa。它位于病毒的囊膜上,主要負責病毒與易感細胞發生融合、進入細胞和產生溶血。F蛋白的前體FO在細胞內被細胞的胰蛋白水解酶裂解為Fl和F2兩條多肽鏈,分子量大小分別為55kDa和12kDa。它們以羧基端嵌合在病毒囊膜上。兩個亞單位以二硫鍵連接,其順序為NH2-F2-S-S-Fl-COOH。裂解后的F1多肽的N端產生一個疏水氨基酸區域,直接參與融合活動。F2的高度疏水可能與融合作用有關。現在研究表明,F多肽有3個高度疏水區,即N端信號肽,F1的N端和C端跨膜區域。有五個糖基化位點,1個在F2多肽上,4個在F1多肽上。信號肽區和融合誘導區分別具有使蛋白跨膜轉位和直接參與膜融合的功能。蛋白跨膜區具有終止蛋白轉移和膜定位的功能。 Toyota等應用一組針對不同NDVF蛋白的單克隆抗體、抗原結構進行分析,認為F蛋白含有3個抗原決定簇,分別位于343,72和161位,其中位點I (Leu-343)位于Fl亞基C末端高度保守的半胱氨酸富集區,在病毒的抗原性及結構和功能上起重要作用。F1和F2裂解位點之間有一個半胱氨酸殘基,有利于位于F2親水區的位點II(Asp-72)同F1N末端接近,形成與抑制融合相關的抗原表位。位點III(Thr-16)位于F1N端,與前兩個位點相比,該區的親水性較低,被認為是病毒的融合體,它使病毒與細胞之間通過疏水作用而融。

1.2.2 HN蛋白 NDV的FIN基因全長2.0kb,基因序列中有一個長的開放式閱讀框,通常編碼577個氨基酸,推測其分子量約為6.3kDa。HN糖蛋白具有血凝素和神經氨酸酶活性,在病毒侵染過程中起著識別細胞受體、介導病毒吸附細胞膜的作用。NDV可被HN單抗和特異性HN蛋白抗血清所中和。應用單抗研究表明HN蛋白的血凝素和神經氨酸酶兩個位點在抗原性上是獨立的。HN蛋白氨基酸序列中有六個潛在的糖基化位點,主要疏水區靠近N端,表明HN是以N端與病毒外膜相連的。多肽N端一側的極性氨基酸親水性分析表明缺乏裂解信號。糖基化作用對FN向膜轉運無作用,但對神經氨酸酶的作用是必需的。Mcinnes和Morrison對NDVAV株的HN蛋白的六個糖基化加成位點進行突變研究表明,糖基化對蛋白質的折疊及活性有重要作用。

1.2.3 NP蛋白、P蛋白和L蛋白 NP蛋白、P蛋白和L蛋白與病毒基因組RNA相結合構成病毒核衣殼。NP蛋白有2個主要區域,一是氨基酸區域,約占NP蛋白的三分之二,它與RNA直接結合;另一是羧基端區域,裸露在裝配后的核衣殼表面,胰蛋白酶處理后,可以從核衣殼上解離下來。P和L蛋白與病毒基因組的轉錄有關,它們與病毒模板一起構成轉錄復合物。其中l蛋白是NDV基因組編碼最大的蛋白,是一種病毒RNA依賴性的聚合酶。有證據表明,P蛋白是病毒特異的。

1.2.4 M蛋白 NDV的M蛋白是一個由346個氨基酸組成的多肽,分子量為39.7 kDa。Yoshida等通過試驗認為,在M蛋白和膜內糖蛋白之間存在著特異的識別位點。Peeple和bratt提出M蛋白與融合糖蛋白(F)之間的重要相互作用對于有感染性的病毒粒子的形成是必需的。除上述蛋白外,NDV基因組還編碼兩種非結構蛋白,分別為33 kDa和36kDa,大概是由P蛋白的同一框架編碼的。

2 NDV致病的分子基礎 隨著分子生物學技術的發展,近年來對NDV的分子結構與致病性的關系進行了深入研究,發現了不同致病性毒株在分子結構上的差異揭示了NDV不同毒力的分子生物學本質。 自1986年Chamber等第一次報道NDV的核苷酸序列以來,已有大量文獻陸續報道了NDV不同毒株的基因序列。經NDV結構蛋白多肽指紋圖譜分析發現,所有NDV毒株NP,P,L蛋白分子結構基本一致,而F,HN蛋白氨基酸卻存在較大差異,并且毒力差異越大,F,HN蛋白氨基酸差異也越明顯。遺傳學分析表明:當弱毒株Lasota的變異株毒力增強時,其NP,P,L,M,HN蛋白均無明顯的差異,而F蛋白的存在形式卻明顯改變。這一結果表明,NDV糖蛋白尤其是F蛋白在NDV致病性上發揮著重要作用。Peeters等在1999年再次報道了F蛋白是一主要決定毒力的蛋白。Marakami利用桿狀病毒表達系統研究NDVHN和F蛋白時發現,單獨表達HN或F蛋白時細胞沒發生融合,而當HN與F基因在同一細胞中表達時,卻有明顯的合包體出現。Morrison等也報道了同樣結果。這表明決定NDV毒力的主要因素是F蛋白,其次是HN蛋白,并且二者有密切的聯系。 NDV的F蛋白先是以惰性前體FO的形式合成,當它轉運到高爾基體表面時,被宿主細胞蛋白酶裂解成F1、F2兩個亞單位,使病毒具有感染活性。裂解后的活性蛋白一旦到達質膜表面即可介導感染細胞與鄰近細胞的融合,并導致病毒新的感染。 F蛋白裂解位點位于112-116位的氨基酸處,其氨基酸順序及裂解能力是決定毒力的關鍵。Collins等對26個NDV毒株進行核苷酸序列比較發現,所有強毒株F蛋白裂解位點的氨基酸組成都是被由谷氨酰胺隔開的堿性氨基酸對組成;而弱毒株或無毒株相應的裂解位點堿性氨基酸對的第一個殘基被Gly取代,另外,強毒株P1多肽首位殘基是Phe,而弱,毒株的該殘基則被Leu取代,即強毒株的切割順序一般為112RRQK/RR/F117;而弱毒株的通常為112GR/KQ-GR/L。這就是NDV毒力強弱的關鍵所在。

3 NDV分子診斷技術研究進展 近年來,在NDV的診斷中出現了"非典型ND",使常規的HA,HI,ICPI,雞胚接種,中和試驗等不能滿足生產實踐的要求。因此,人們試圖從核酸水平檢測NDV并對強弱毒株進行區分。其中主要有RNA指紋圖譜法,核酸探針法,裂解位點分析法及其多肽抗體法和PCR方法。Mcmillar等首先用RNA指紋圖譜法對Lasota株進行了分析。其方法是用T1RNase降解病毒RNA,然后在聚丙烯酰胺凝膠上進行二維電泳并放射自顯影,得到RNA各片段的分布圖,并提出作為NDV檢測和分析的一種手段,隨后他們又對許多株進行了分析,確定了其圖譜和同源性。 Jarecki-Black設計了與NDVF基因5'端非編碼區互補的核苷酸探針,用該探針檢測了14個NDV毒株,包括強毒,中毒和弱毒,都出現了極好的雜交,同時該探針不與禽流感病毒(A)V),傳染性支氣管炎病毒(1BV),傳染性法氏囊病毒(1BDV)雜交,說明該探針是特異的。1993年他又設計了兩個探針,該探針的長度為21個堿基,與強毒株TEXASGB的F蛋白的裂解位點基因互補,可與11個速發性毒株,5個中發性毒株的RNA雜交,而不與所有的7個弱毒株的RNA雜交,這說明該探針能將弱毒株從強毒株和中毒株中區分出來,具有重大的應用價值。Angela等(1998)利用RT-PCR擴增出362bp的包括F蛋白裂解位點序列的片段,制備成了相應的探針,并用PCR產物同型特異性探針雜交來區分德國流行的強弱毒株。 Hodder等利用強毒株Australia-Victorta(AV),弱毒株Queenstand(U4),Eaves-Grimes(EG),WA2U6株的裂解位點的氨基酸的組成和序列不同,設計并人工合成了兩個多肽,針對強毒株的序列為Ser-Gly-Arg-Arg-Gln,針對弱毒株的序列是:Ser-Gly-Gly-Glu-Arg-Glu-Glu,將這兩個多肽分別與載體連接制備兔抗血清,用抗血清可以區分不同毒株的毒力強弱。王樹雙等利用相似的方法,通過免疫印跡對6種不同抗多肽抗體分析了國內現有的部分毒株毒力的強弱,結果與接種雞胚致死情況基本吻合。 PCR是一種體外擴增特異性基因片段的技術,在疾病的檢測方面有著廣闊的應用前景,現已被廣泛應用。Jestin設計一對分別為18和19個堿基的引物,分別對應于NDVF蛋白/基因的一定區域,擴增出一個238bp的片段,產物經酶切鑒定,證明是特異的,能用于NDV的診斷和檢測。宋長緒等等也設計了針對NDVF基因裂解位點的引物,可以以強、中、弱毒株核苷酸為摸板,擴出一個480 bp左右的片段,對IBV、EDS-76的核苷酸而擴增不出,說明該PCR方法是對NDV是特異的,可以用來診斷和檢測NDV。Kant.AL24J(1998)利用4條引物A,B,C,D配成AB,AC,AD三對,AB針對所有毒株,AC針對強毒株,AD針對弱毒株,分別對只通過組織勻漿而提取的NDV-RNA進行RT-PCR,結果擴增出362,254,254bp的三個片段。他用RT-PCR方法對11個NDV強毒株,4個NDV無毒株進行擴增,結果證明,該方法與傳統方法檢測結果基本吻合。該方法不需要雞胚接種,節省了時間,24h之內便可以出結果,為NDV毒株的區別診斷提供了手段。但這種方法要求病毒滴度至少在10sED50/mL。而套式PCR會增加靈敏度,但是套式PCR方法易交叉污染。

4 NDV基因工程苗研究 疫苗接種是防制ND的有效措施。目前,常用弱毒苗和油乳劑滅活苗免疫。弱毒苗價格低、效果好,但易導致病毒散播;滅活苗安全可靠,但存在免疫期短、成本高、使用較復雜的缺點。NDV血清型單一,主要靠體液免疫。亞單位苗保護率高。因而ND基因工程苗的研制已成為國內外研究的熱點。 Epsion等將Italian株的F蛋白基因插入痘病毒的基因組中,并置于P 7.5轉錄控制序列之下,用CV-1細胞進行共轉染,使F蛋白在細胞表面獲得了有效的表達。Meulemens用此重組病毒分別對1日齡雛雞和成雞進行了免疫,盡管免疫效果很好,但其缺點是明顯的,即痘病毒對人類的健康構成潛在的威脅。Bourshel![27]將Beaudettec株的HN基因插入禽痘病毒的一個非必需區,置于痘病毒P7.5啟動子的控制之下進行表達,產物分子量大小與設計結果完全相符,用HN單抗進行Western-blot也能檢出表達產物,用表達產物靜脈注射或翼下刺種免疫雞,可以抵抗NDV強毒的攻擊,保護率達100%。Nagy等將B1株的HN基因插入桿狀病毒表達載體,重組的HN基因在粉紋夜蛾細胞中獲得了表達,表達產物表現HN活性,而且其HN活性能被NDV多抗或抗HN單抗所抑制。提純的HN蛋白免疫雞,產生的抗血清在ELISA和Westernblot反應中與NDV產生特異反應。Mori等利用昆蟲桿狀病毒作載體表達D 26株F基因,能夠表達出分泌到細胞膜表面的F蛋白。用重組病毒感染蠶蛹,制備出的NDV亞單位疫苗,可以抵抗NDV強毒的攻擊。 Morgan等LaOJ將NDVF基因和HN基因分別插入HVT的一個非必需區中,插人的基因受勞斯肉瘤病毒(RouseSarcoma)長末端重復序列的強啟動子啟動,重組HVT株穩定,且能完全感染雞和離體培養的細胞。家禽1日齡腹腔內一次接種帶有F基因重組HVT,能夠產生免疫反應并在28日齡時用NDV攻毒保護率大于95%。而接種表達HN蛋白的重組HVT的雞保護率只有47%,重組HVT和親本在用超強毒MDVRB,B株攻擊時,對雞產生相同的保護,這說明外源基因的插入不影響HVT對MD的保護作用。張秀根等將NDVF蛋白基因插入到HVTTK基因的NheI位點,構建轉移載體質粒pTKF與HVT重組后,轉染CEF細胞,經Western-blot檢測,發現細胞上清和細胞中均可檢測到F蛋白,用表達的蛋白給1日齡雛雞腹腔注射,結果表明重組HVT可誘導產生較高的抗F蛋白ELISA抗體,且可明顯降低NDV強毒攻擊引起的發病率和死亡率。 NDV的分子生物學研究已取得相當大的成就。F基因和HN基因序列已基本弄清,與它們相對應的F蛋白和HN蛋白是與NDV致病性和抗原性有密切的關系的蛋白。有關它們的克隆與表達將會更進一步深入。NDV基因工程疫苗將有廣闊的開發前景。相信在不久的將來,NDV基因工程疫苗必將以其獨特的優勢為控制及消滅ND作出貢獻。

    共有條評論發表評論
    用戶名: 密碼:
    驗證碼: 匿名發表
    CopyRight 農業戶 http://www.inwfls.icu 版權所有
    吉ICP備11001780號-1
    pk10走势图判断