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新型生物殺蟲劑--刺糖菌素

時間:2014-10-02 16:29:06  來源:  作者:李榮貴; 王 普

刺糖菌素是由多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)產生的次級代謝產物,其主要活性成份為刺糖菌素A組份(Spinosyn A)和刺糖菌素D組份(Spinosyn D)。多刺糖多孢菌是一種新型的放線菌,它是由一位化學家在加勒比海度假時從一個廢棄的甘蔗制甜酒廠附近土壤中分離得到的,通過對其發酵液的抗蚊蟲幼蟲活性測定發現了刺糖菌素。由美國陶氏益農公司(DowAgrosciences Company)生產的2.5%懸浮劑(商品名:菜喜)和48%懸浮劑(商品名:催殺)已獲得我國農藥的臨時登記,分別用于防治甘藍的小菜蛾和棉花的棉鈴蟲。 刺糖菌素是一種具有觸殺及攝食毒性的廣譜殺蟲劑,對鱗翅目害蟲的防治效果最好。與一般的殺蟲劑相比,刺糖菌素兼具生物農藥的安全性和化學合成農藥的快速效果,并因其低毒、低殘留、對天敵安全、分解快而獲得美國"總統綠色化學品挑戰獎"。有關刺糖菌素的研究國內尚屬空白。

1 刺糖菌素的結構

1990年,Boeck等人首次從多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)NRRL-18395培養液中分離出了刺糖菌素組份A、B、C、D、E、F、H、J和刺糖菌素A假糖苷配基,其中刺糖菌素A組份約占85%-90%,D組份約占10%-15%,刺糖菌素B、C、E、F、H、J組份和刺糖菌素A假糖苷配基均為次要組分。到目前為止,另外還發現了15種刺糖菌素類化合物,包括刺糖菌素組份K、L、M、N、O、 P、 Q、 R、 S、 T、 U、V、W、Y。 Kirst等人通過光譜學(NMR,MS,UV,IR)和x衍射晶體學方法確定了刺糖菌素A的結構,其母核是由一個5,6,5-順-反-順三環和一個十二元的內酯環粘合而成。另外,一個氨基糖(β-D-福羅糖胺)和一個中性糖(a-L-2,3,4-三氧甲基鼠李糖)分別通過糖苷鍵連到刺糖菌素A的母核上。刺糖菌素其它組分的結構則可通過光譜學方法(NMR,MS,UV,IR)以及通過與刺糖菌素A的結構加以比較后確定。1998年,Paquette等人采用化學方法對刺糖菌素A進行了全合成,雖然這種方法目前尚沒有實際應用價值,但它卻從一個側面證實了刺糖菌素的結構。從結構上講,刺糖菌素屬大環內酯類化合物,但和一股Bg大環內酯類化合物相反,刺糖菌素沒有抑菌活性,卻有殺蟲活性。

2 刺糖菌素的生物合成 與一般的大環內酯類化合物相似,刺糖菌素也是由乙酸和丙酸單位通過多烯合成途徑進行合成的,但其合成過程也有獨特之處:

(1)3個分子內C-C鍵(C3·C14,C4-C12和C7-C11)的形成和環的閉合明顯是通過4+2成環加成反應和羥醛縮合反應或米歇爾縮合反應進行的。

(2)L-鼠李糖和D-福羅糖胺是在內酯化形成糖苷配基后分別連到9位和17位羥基上的,然后,再對鼠李糖的2,3,4-羥基進行甲基化。從刺糖菌素的合成途徑來看,其大部分次要組份的形成,可以認為是鼠李糖的氧甲基化程度不同、福羅糖胺的氮甲基化程度不同以及長鏈脂肪酸中間體在組裝過程中乙酸和丙酸單位相互交換的結果。

 3 刺糖菌素的物理、化學及生物學性質

3.1 刺糖菌素的物理性質 刺糖菌素的實用性產品為白色或淺灰白色固體,帶有一種類似于輕微陳腐泥土的氣味,是85%-88%的刺糖菌素A組份和12%-15%的刺糖菌素D組份的混合物。熔點:A組份為118℃,D組份為169℃;蒸氣壓:A組份為3.2×10-l0Pa,D組份為2.1 ×10-l0Pa;水中溶解度(mg/L):A組份在pH5、7、9時分別為290、235、16,D組份在pH5、7、9時分別為29、0.332、0.053。

3.2 刺糖菌素的化學性質 酸堿穩定性:在pH5-9范圍內,刺糖菌素A組份和D組份都比較穩定。在溫和酸性條件下(濃鹽酸,甲醇,回流2h),刺糖菌素A和D容易分解生成各自的17位脫糖基假糖苷配基,在更為劇烈的條件下(7.2mol/L硫酸,甲醇,回流3h),糖菌素A會繼續脫去9位的鼠李糖生成刺糖菌素A假糖苷配基,而刺糖菌素D則因為分子內重排未能得到刺糖菌素D假糖苷配基。環境穩定性:刺糖菌素在環境中通過多種途徑組合的方式進行降解,主要為光降解和微生物降解,最終降解成C、H、O、N等自然組分。刺糖菌素由土壤光解作用降解的半衰期為9-10d,而水光解作用的半衰期則小于1d,葉面光降解的半衰期是1.6-16d。在無光照條件下,刺糖菌素經有氧土壤代謝的半衰期為9-17d。

3.3 刺糖菌素的生物學性質 作用方式:現已知道各類殺蟲劑有多種不同的作用方式,包括有機磷和氨基甲酸酯是乙酰膽堿酯酶的抑制劑,滴滴涕和擬除蟲菊酯是Na+通道的阻斷劑,阿維菌素是7-氨基丁酸受體C1-通道的激活劑,吡蟲啉和煙堿是煙堿型乙酰膽堿受體的拮抗劑,溴蟲腈和魚藤酮是線粒體呼吸作用的抑制劑,而蘇云金芽孢桿菌是通過形成內毒素,并結合到昆蟲腸細胞膜的高親和性和特異性受體上,從而干擾K+離子依賴性活性氨基酸運輸而起作用。電生理實驗證明,刺糖菌素作用于昆蟲的神經系統,導致非功能性的肌收縮,衰竭,并伴隨顫抖和麻痹。刺糖菌素具有影響乙酰膽堿受體的功能,但其作用位點不同于吡蟲啉和煙堿。此外,刺糖菌素還可影響γ-氨基丁酸受體,但其作用位點與阿維菌素不同。迄今為止,尚未發現某類產品能以相同的方式影響昆蟲的神經系統,而且尚無有關刺糖菌素交叉抗性的報道。毒性:根據中國農藥毒性分級標準,刺糖菌素屬低毒殺蟲劑。對哺乳動物低毒:大鼠急性經口LD50>5,000mg/kg(雌),3783mg/kg(雄),小鼠急性經口LD50>5,000mg/kg,兔急性經皮LD50>5,000mg/kg,大鼠急性吸入LC50>5mg/kg;對鳥類低毒:野鴨急性經口LD50>2,000mg/kg,鵪鶉急性經口LD50>,2,000mg/kg;對魚類毒性較低:96h急性LC50鱒魚為30mg/L,藍鰓魚為5.9mg/L,鯉魚為5mg/L。另外,對哺乳動物的慢性毒理試驗表明刺糖菌素無致畸、致突變、致癌作用。殺蟲譜:刺糖菌素屬廣譜殺蟲劑,它對鞘翅目、雙翅目、同翅目、膜翅目、等翅目、鱗翅目、纓翅目以及螨蟲等昆蟲都有殺蟲活性。對鱗翅目昆蟲而言,刺糖菌素是目前已發現的殺蟲劑中選擇性最高的化合物之一。此外,它對薊馬、虱、白蟻以及許多雙翅目和膜翅目害蟲也有較好的效果。

4 刺糖菌素的發酵生產

4.1 菌種特性 多刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)屬糖多孢菌屬,是一種好氧型革蘭氏陽性的非抗酸性放線菌。它在大多數培養基(如ISP2、ATCCl72、蘋果酸鈣等)上都能生長良好,形成氣生菌絲體。氣生菌絲為粉黃色,營養菌絲為黃色到黃褐色,產淺粉黃色孢子,在某些培養基上則產生白色孢子。孢子鏈外觀為珠狀,有孢子殼,孢子殼表面為針狀。菌體生長溫度為15℃-37℃,對溶菌酶敏感,在高滲條件下(11%NaCl)可以生長。

4.2 搖瓶發酵 將保藏于冷凍干燥管或液氮安瓿瓶中的菌種轉接斜面,其成份為酶解酪蛋白、酵母膏、MgS04·7U20、葡萄糖和瓊脂,接種后的斜面30℃培養10-14d。成熟后的斜面孢子用于接種一級營養培養基,成份為酶解酪蛋白、酵母膏、MgS04·7H20、葡萄糖和甘油,在30℃,250r/min振蕩培養48h。然后以5%的接種量接種生產培養基,其成份為葡萄糖、胨化牛奶、棉子餅粉、CaCO3和油酸甲酯,28℃-30℃,250r/min振蕩培養6-8d后,用于產物的測定或分離純化。

4.3 攪拌式生物反應器發酵 將培養成熟的一級種子培養液以2.5%的接種量接種二級種子培養液,30℃,250r/min培養48h后,以5%的接種量接種裝有115L生產培養基的165L攪拌式生物反應器,30℃發酵8-10d。發酵過程中維持溶氧水平≥飽和度濃度的50%。

4.4 刺糖菌素的分離 在發酵液中加入等體積的丙酮萃取,過濾,濾液用NaOH調pH至10,加入1/2發酵液體積的乙酸乙酯,分層后棄去水相,有機相減壓濃縮到1/2發酵液體積,用1/2發酵液體積的酒石酸(0.1mol/L)萃取,分層,減壓蒸發除去水溶液中可溶性的乙酸乙酯,利用反滲透操作濃縮水溶液,用NaOH調節濃縮后水溶液的pH值至10-11,過濾,分出沉淀物,水洗,真空干燥,得到刺糖菌素成品。

4.5 刺糖菌素的測定 HPLC是刺糖菌素測定的常用方法,其各個組份都可用HPLC進行定性或定量分析。對刺糖菌素A組份和D組份測定時可采用如下HPLC系統:色譜柱為C18柱;流動相為乙腈、甲醇及水的混合物,其中含少量乙酸銨;檢測波長為250nm。另外,Lee等人還報道了采用熒光免疫測定方法檢測刺糖菌素A組份。

 5 結論與展望 以低毒的新型生物源農藥取代目前大量使用的毒性較高的化學農藥,已越來越受到重視,并成為研究開發的熱點。刺糖菌素是一種新型的微生物源殺蟲劑,它的優越性能包括:獨特的化學結構和作用方式,對影響經濟的重要害蟲具有極高的活性,半衰期短,易降解,對哺乳動物、魚類、鳥類及大多數益蟲具有極高的安全界限。由于刺糖菌素的優越性能,使其有望成為新一代殺蟲劑的主要品種。該產品的開發具有很好的經濟效益和社會效益。 今后的研究方向:(1)對刺糖菌素進行化學修飾,并對刺糖菌素的構效關系作深入研究,以開發出效價更高、殺蟲譜更廣的刺糖菌素類似物。 (2)利用基因工程手段對多刺糖多孢菌進行轉基因研究,提高刺糖菌素的發酵水平。 (3)利用基因工程手段改變刺糖菌素的代謝途徑,為進一步的結構修飾提供先導化合物。

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