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昆蟲抗真菌肽研究的科學意義及其應用前景

時間:2014-09-26 16:15:57  來源:  作者:楊婉瑩; 張 倩; 黃亞東; 溫碩洋; 曹 陽

昆蟲抗真菌肽(1nsect antifungal pep-tide)及其抗真菌肽基因的研究是近幾年國內外偶有報道的一個新的關注點。國內外學者對其給予的重視,首先在于目前對昆蟲抗菌肽(Antimicrobial peptide)及其抗菌肽基因的研究已相當深入,并已在植物轉基因抗病育種和生物制藥開發領域得到利用。但是大多數已報道的昆蟲抗菌肽對絲狀病原真菌無明顯的抑殺作用。所以,如果能從昆蟲中發現、分離到既抗細菌又抗真菌的雙效抗菌肽因子,不言而喻,這將進一步提高昆蟲抗菌肽因子在生物技術領域的應用前景。其次,隨著現代醫學對人類淺部真菌病,特別是對深部真菌病危害的認識加深,過去用于治療人淺部真菌病的各種外用藥劑,不可能用于人的內臟深部真菌病的治療。顯然,如果能發現具有雙效抗性的昆蟲抗真菌肽因子,則可能是昆蟲抗菌肽研究中更有前途的生物制藥開發對象之一。 據此,本文擬就學術界對昆蟲抗真菌肽及其基因的研究進展、科學意義和應用前景進行初步討論,以求獲得國內同行和企業對此方向給予更多的支持和參與。

1.昆蟲抗真菌肽研究進展簡要及其科學意義 1993年Rysuke I等首例報道了由麻繩(Sarcophaga peregrina)3齡幼蟲血淋巴分離純化的AFP(Antifungal protein)抗真菌肽蛋白,它對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌無明顯的殺傷作用,但對酵母等真菌Candida albicann(白色假絲酵母菌)、Sac-charomyces cerevisiae(啤酒糖酵母菌)和Shzosaccharomycespombe(粟酒裂殖酵母)存在不同程度的抑制作用。繼后不久,SoYoung Lee等于1995年在鞘翅目昆蟲東北大黑鰓金龜(Holotrichia dioraphalia)幼蟲血淋巴中分離到Holotricin3抗真菌肽蛋白,同樣對白色假絲酵母菌(C.albicans)表現出強烈的抑菌效果。研究表明這兩類蛋白屬于昆蟲組成性抗真菌肽蛋白,與昆蟲免疫誘導型的抗菌肽有所不同。 對具免疫誘導型的昆蟲抗真菌肽因子的發現,幾乎同時始于1994年PascaleFehlbaum等人的研究結果。他們用M.1uteus和E.coIi等誘導,由果蠅血淋巴中分離到一個44aa的短肽,被命名為Drosomysin,對其初步的抑菌譜研究結果表明,Drosomysin對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌無抑殺作用,但對8種絲狀病原真菌具有很強的抗性。Drosomysin是在昆蟲中首次報道的誘導型抗真菌肽。緊接著,Pascale Fehlbaum等又于1996年用E.coli誘導,從斑腹刺益蝽(Podisus mac-uliventris)血淋巴中,發現了既對革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌有抑制作用,又對7種病原真菌(包括植物病原真菌和人病原真菌)有強烈抑殺作用的抗真菌肽因子Thanatin。1999年MimiIIe Lambery等同樣采用M.Iuteus和E.coli誘導綠棉鈴蟲(Heliothis virescens,又稱煙芽葉蛾)幼蟲血淋巴,獲得了對絲狀病原真菌和酵母菌有較強抑制作用的抗真菌肽因子Helion-micin,但Hdiomicin對革蘭氏陰性和陽性細菌卻無抑殺作用。筆者等對上述三類新發現的誘導型昆蟲抗真菌肽文獻進行分析,推測這三種抗真菌肽因子可能都是屬于昆蟲防御素(Insect defensins)簇的抗菌肽。此外還有關于由黃色粉蛀蟲(Tenebriomolitor)發現的Tenecin 3的報道,也是屬于誘導型的昆蟲抗真菌肽因子。 就目前國外學者已發現的上述6種昆蟲抗真菌肽因子大小而言,其氨基酸殘基長度為21-194aa,其中最短的Thanatin因子由21aa組成,最長的為Holotricin 3,由104aa組成。曹陽等根據文獻分析,發現這些昆蟲抗真菌肽因子之間的氨基酸同源性較低,但在其三個功能區的同源性則明顯增大。顯示具有序列同源的功能進化關系。雖然國外目前對于這些已發現的昆蟲抗真菌肽及其基因做了初步研究,包括對其氨基酸組成、理化性質、殺菌譜、同源性,甚至對個別昆蟲抗真菌肽因子,例如對Heliomicin(MireiIIe Lambery等,1999)還進行了重組肽的抑菌功能分析,但是有關上述抗真菌肽因子的殺真菌機理等分子生物學問題,特別是它們與昆蟲其它抗菌肽,如天蠶素簇殺菌肽(Cecropin family)、昆蟲防御素(Insect defensins)、雙翅肽(Dipterioin)、蜜蜂肽(Apidaecins)、鞘翅肽(Coleoptericin)的關系等,尚存許多不明晰的地方,有待繼續深入研究(MimiHe Lam-bery等,1999)。 昆蟲是世界上最豐富的動物類群,其種類達108,個體數量超過106,具有廣泛的適應性和較強的生存力。有理由相信,那此生活在潮濕腐生環境完成主要生活周期的昆蟲種,應該具備不同方式以抵御真菌病害侵染的機制,其中在昆蟲基因組水平上具有的組成性或誘導型昆蟲抗真菌肽基因,可能就是其中之一。基于上述理由,華南農業大學蠶學分子生物學與生物技術實驗室課題組從1999年秋開始了以篩查、發現新的昆蟲抗真菌肽基因為目的的研究工作,先后獲得了國家教育部高校骨干教師資助計劃、國家自然科學基金和廣東省自然科學基金的資助。研究工作已獲得了良好進展。課題組首先采用基因片段合成結合PCR擴增方法,人工合成了Thanatin抗真菌肽基因,并將其構建成表達載體pET-21d-出(王艷等,2000,待發表),同時采用嵌合引物分段PCR方法,人工合成了與天蠶素族抗菌肽CAD基因(抗菌肽CecropinAD基因)融合的雙價基因,構建成表達載體pET-21d-thCAD(黃亞東,曾錦秀等,2000,待發表),初步的抑菌試驗表明,這兩種載體分別表達的Thanatin蛋白和Thanatin-CAD融合蛋白對綠色木霉(Trichoderma viride)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)有抑制作用。由基因組水平上篩查新的昆蟲抗真菌肽基因的研究也取得重要進展,先后從近40種不同昆蟲種的篩查工作中發現,有13種昆蟲的基因組中可能含有新的昆蟲抗真菌肽基因(張倩、溫碩洋等,2001,未發表)。上述工作的繼續深入研究,無疑將對今后昆蟲抗真菌肽的基礎理論研究和拓展應用提供新的內容。 對昆蟲抗真菌肽開展廣泛的基礎理論研究,特別是有關它的生物學、遺傳學、分子生物學研究將揭示它與昆蟲抗菌肽的功能進化關系,豐富和發展人類對昆蟲防御蛋白機制的本質認識,更進一步促進人類對昆蟲抗菌肽、抗真菌肽的有效利用。

2 .昆蟲抗真菌研究的應用前景 鑒于大多數昆蟲抗菌肽對細菌的廣譜高效殺滅作用,對某些病毒、癌細胞、原蟲也有一定的抑制效果(濯朝陽,1996;黃自然等,1986;韓獻萍等,1994;黃亞東等,2000),將昆蟲抗菌肽基因導人植物抗病育種研究是近年來非常活躍的領域之一(賈士榮等,1996;田長恩等,2000;李乃堅等,1998;葉志標等,1993;黃大年等,1997;簡玉瑜等,1997)。同樣,由于昆蟲抗菌肽對細菌細胞膜具有穿孔損傷的獨特機制,不易使微生物產生抗藥性等獨特優點(BomaHG,1995),研制開發昆蟲抗菌肽作為一類新型生物制劑或藥物正在受到人們廣泛的重視。但是如前所述,這些昆蟲抗菌肽大多數對絲狀病原真菌無抑殺效果,因而在昆蟲抗菌肽的生物技術應用前景上將始終受到一些限制。顯然,廣泛深入開展昆蟲抗真菌肽及其基因研究,將大幅度拓寬昆蟲抗菌肽基因工程、生物技術開發利用的應用前景。 我國已于2001年12月加入WTO,這將意味著目前我國制藥行業生產的許多仿制、未經專利授權許可的藥品,將停止生產或不得不重新向國外申請專利授權,這是我國醫藥制藥行業進入WTO后面臨的嚴峻問題。因此生產研制具有我國自主知識產權的新藥是我國今后面臨的一項主要任務。從廣泛的昆蟲種篩查、鑒定新的昆蟲抗真菌肽基因,研制開發具有我國自主知識產權的用于治療人外部真菌皮膚病和內臟深部真菌病的新藥,無疑將具有特殊的意義,對國家、對社會、對企業都將帶來巨大的經濟效益和國際影響。

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