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動物有機微量元素吸收機制及吸收研究方法的進展

時間:2014-10-02 15:11:15  來源:  作者:計 峰; 羅緒剛

現代畜牧業生產中,常使用藥理效應添加水平無機來源的鋅、銅等促進豬生長,結果可能導致環境污染。為減少飼糧中超量微量元素隨糞便排泄對環境的污染,研制更有效的微量元素產品已成為微量元素營養研究的熱點。20世紀70年代,微量元素氨基酸絡合物的研究推動了科學工作者對該類絡合物在動物營養中的研究與應用。一些研究顯示,金屬蛋白鹽或絡合物的生物學利用率高于其無機物。這一現象引起了人們的注意,對以氨基酸微量元素絡合物為代表的有機微量元素的研究方興未艾。 當人們致力于尋找更為有效的微量元素營養源時,迫切需要一種較為快速、簡便和有效的分析方法,以評定微量元素的生物學活性。為此,人們努力嘗試在體外模擬胃腸道消化環境和消化后的吸收情況,以期了解元素在體內的吸收。本文綜述了有機微量元素的吸收機制和微量元素吸收的研究方法的最新進展,以便深入了解有機和無機元素在動物體內吸收和代謝的異同,為在畜牧業生產中科學、有效地應用微量元素添加劑提供理論依據和方法學指導。

 1 絡合態元素的檢測方法 有機微量元素產品品質是影響有機與無機微量元素作用效果的重要因素。但無論是AAFCO還是AOAC(美國正式分析化學協會)至今都沒有提出鑒別有機微量元素的絡合率(即絡合態元素的比例)和絡合強度(即絡合物的穩定常數)的有效方法。 離子選擇性電極法、氧化還原電位滴定法、色譜法可用于測定絡合體系的絡合率。電極法和電位法之類電化學分析方法有很多不足,一是只能間接籠統地測得游離或絡合金屬離子的總量,而不能直接得到不同分子量分布的絡合物組分;二是方法準確度差;由于電位測定法一般要求樣品的濃度較低,所以樣品大都經過稀釋方能測試,而濃度對絡合反應影響很大,溶液稀釋后絡合平衡會發生移動,所以電化學方法的結果不能代表真實情況;三是方法局限性較大。如離子選擇性電極法, 目前僅限于Cu2+、Cd2+等少數幾種離子有選擇性電極,且性能不太穩定;電位法測定要求有和組分離子相同的高純度金屬材料,且必須有很好的氧化還原穩定性,但是電極的制備缺乏標準, 人為因素影響較大(張曉鳴,1999)。Cao(1998,2000)利用凝膠色譜柱對不同分子量物質的分離能力檢測緩沖液中游離態和絡合態鋅,結果表明在pH值為2和5的緩沖液中,有機鋅產品的洗脫峰與硫酸鋅中鋅離子的洗脫峰相同,而對于有機鋅產品的中性水溶液,在離子態鋅的洗脫峰之前還出現一個較小的洗脫峰,說明此條件下小部分鋅為絡合態。其后,Guo(2001)證實了這種方法檢測游離態和絡合態銅的有效性,但是此方法不能檢測不溶性部分的絡合率。Leach認為,高壓液相色譜性(HPLC)及其它分離技術如膜滲透法,常規下無法用于金屬絡合物,這是由于溶液中的金屬絡合物總是處于游離金屬與配位體的動態平衡狀態。該平衡溶液組分的分離可導致絡合物快速分解,這種分解通常比HPLC或滲透分析技術更快,這樣就會得出有問題的結果。 極譜法可用于測定飽和溶液中有機微量元素的絡合強度(Holwerda,1997),但是不能得出游離態和絡合態元素的比例,并且在動物的消化道中并不存在飽和溶液。 微生物生長分析法是指在限氮條件下,利用瘤胃微生物降解含氮的有機微量元素產品而生長的情況, 評價有機產品在模擬瘤胃環境下的穩定性(Heinrichs和Conrad,1983),此方法不適用于載體中含氮的產品。 核磁共振、X-光衍射和近紅外光譜法用于檢測固體樣品中有無絡合態元素存在(Hynes和Kelly,1995),它只是一種絡合態結構的定性分析,不能對絡合率或絡臺強度進行定量分析,而且不適用于液體樣品的檢測。 上述方法均是測定有機微量元素產品的絡合率或絡合強度的方法。這些方法能否用于體內(如腸液、黏膜細胞液和血液中)游離態和絡合態元素的檢測有待于進一步研究。一些學者對體內絡合態元素的檢測也進行了一些嘗試。Hempe等(1989)采用高壓液相色譜(HPLC)分離大鼠腸黏膜細胞液和血漿中與65Zn結合的組分,發現飼喂氯化鋅與EDTA混合物組的黏膜細胞液比氯化鋅組多一個色譜峰(其峰位相應于EDTA鋅),而血漿中未發現類似情況。這說明EDTA鋅是以完整的形式進入黏膜細胞,通過基底膜時發生解離。David等(1982)用電子順磁共振(PER)測定出大鼠肝細胞內總Mn2+為35nmol/ml細胞液,游離Mn2+為0.7nmol/m1細胞液,其原理是游離錳(II)在ESR譜圖上出現六重超精細譜,而被鍵合了的錳(II)卻沒有。此方法能否避免破壞游離態和絡合態之間的平衡,能否用于不同樣品絡合態元素的定量分析,無疑值得深入研究。

2 有機微量元素的吸收機制假說

2.1 完整吸收假說 一種觀點是金屬氨基酸絡合物和其蛋白鹽利用肽和氨基酸的吸收機制被完整吸收,而并非小腸中普通金屬的吸收機制。此觀點的核心是金屬離子以共價鍵和離子鍵與氨基酸的配位體鍵合,被保護在絡合物的核心,并且金屬絡合物以整體的形式穿過黏膜細胞膜、黏膜細胞和基底細胞膜進入血液。Evans(1975)認為鋅必須和胰腺分泌的小分子量蛋白配體(二肽)形成絡合物才能被動物吸收。體外(in vitro)和原位(in situ)研究也表明,當存在大量的半胱氨酸和組氨酸時,它們可與鋅生成穩定的絡合物,因此可大大增加小腸對鋅的吸收和運輸(Kirchgessner,1983)。 Ashmead等(1985)的試驗結果表明大鼠分離腸段對蛋白質螯合銅的吸收率是硫酸銅的4倍。Lowe等(1994)報道,狗口服蛋氨酸鋅的吸收率與氨基酸相似,說明蛋氨酸鋅可能以完整形式吸收進入腸上皮細胞,并以完整肽的形式進入循環系統。Koike等(1964)根據雙標記鋅-EDTA絡合物中的65Zn和14C在雛雞血液中的含量等比例,推斷鋅-EDTA絡合物可完整吸收。而Hill等(1987a)發現,雙標記蛋氨酸鋅螯合物的'14C和65Zn在鼠外翻腸囊中的吸收不成比例,因此他認為氨基酸鋅絡合物不能完整吸收,并且在腸囊培養物中添加氯化鋅、蛋氨酸鋅和賴氨酸鋅的結果表明,有機鋅和無機鋅的生物學效價相似。由于缺乏絡合態元素的有效檢測方法,以及哺乳動物的食糜的非穩態和腸腔主要參數如pH值和食糜通過率的流動狀態,使得研究有機微量元素的吸收機制非常困難。目前尚無直接的試驗證據可以證實微量元素絡合物或其蛋白鹽是以整體形式通過氨基酸或肽的吸收機制被吸收。 

2.2競爭吸收假說 另一種觀點(Miller,Ashmead引用,1993)認為,微量元素氨基酸絡合物和其蛋白鹽能更有效地吸收,并非必須以整體和電中性形式實現。金屬絡合物中微量元素的吸收利用率高可以用競爭吸收機制來解釋。絡合程度適宜的有機微量元素進入消化道后,可以防止金屬元素在腸道變成不溶性化合物或被吸附在有礙元素吸收的不溶解膠體上,而直接到達小腸刷狀緣,并在吸收位點處發生水解,其中的金屬以離子形式進入腸上皮細胞并被吸收入血液,因此進入體內的微量元素量增加。這一觀點強調的是有機微量元素到達吸收部位的量比無機形態的多。Hynes和Kelley(1995)指出,這種"保護"程度將受到pH值和絡合物本身的穩定性的影響。Powell等(1999b)認為,如果配位體大量存在并足夠有力地與黏液競爭,金屬將促進金屬通過黏液層障礙。Aoyagi(1994)在雛雞飼糧中分別添加蛋氨酸銅、賴氨酸銅和氯化銅,結果表明氨基酸銅絡合物和無機鹽對吸收抑制劑的反應不同,絡合劑可部分減輕L-半胱氨酸和L-抗壞血酸對銅吸收的抑制作用。

3 微量元素吸收的研究方法

3.1 體內法

3.1.1 平衡試驗 平衡試驗是應用最廣泛的方法。通過準確測定元素的食入量和排出量計算元素的表觀吸收(食入量-糞中含量)和元素的存留(食入量-糞中含量-尿中含量)。這種方法所需設備簡單,可以測定完整日糧中元素的吸收、存留,并能為估計元素的需要量提供有用的信息。但平衡試驗有低估元素吸收的趨勢。因糞中有來自胰腺、膽管和腸道分泌的內源部分;且測定進食量和排出量時小的誤差會引起計算存留時的大誤差,元素吸收水平低時更是如此(Wienk等,1999)。雖然可以通過延長試驗期、增加試驗動物數量來提高試驗的精確性,但會消耗大量的人力、物力和財力。此外,平衡試驗多用于研究全價飼糧,對于單一飼料則由于其不能提供動物以全價的營養,使動物處于非正常營養狀態下,所以平衡試驗用于研究單一飼料原料中某種元素的吸收是有局限的。 盡管平衡試驗不能提供關于元素吸收部位的任何信息,但平衡試驗畢竟是經典的測定表觀吸收的方法。使用該方法,動物處于自然生長狀態,其試驗結果最接近動物自身情況,對生產實際具有指導意義,是與其他研究方法相比較的參照方法。

3.1.2 同位素示蹤技術 20世紀50年代,放射性同位素技術開始廣泛應用于動物代謝和臨床研究(商照榮,1992)。同位素技術的主要優點有:(1)靈敏度高,放射性的檢測水平可達10-18~10-19g,而普通化學分析法的靈敏度只有10-12g;(2)操作簡單,可直接測定樣品,不需要繁瑣的前處理;(3)放射性核素的引入量低,比較接近動物體正常的生理狀態(董曉蕙,2001)。 同位素示蹤技術大大提高了試驗的準確性,平衡試驗中若引入放射性同位素,可以測定元素的真吸收率。Weigand(1980)給大鼠飼喂5.6~141 mg/kg 6種水平鋅,發現鋅的真吸收率隨鋅水平的升高而增加。但是,由于飼料本身所含的天然標{己物(內源性標記)極少,所以使用同位素示蹤技術的前提是向飼料中添加的標記化合物(外源性標記)和內源元素可以完全混合,通過測定同位素的分布能夠了解元素在動物體內的代謝途徑。然而,有試驗表明二者之間存在顯著差異(Bedi等,1982;Neathery等,1975;Meyer等,1983;Fairweather-Tait等,1991;Janghorbani等,1982)。放射性同位素進入體內貯備庫后,放射性被稀釋,有可能低估實際值,因此對其結果的解釋應慎重。 目前人體試驗多使用穩定性同位素,穩定性同位素可避免射線對試驗對象的傷害,是一種較為安全的方法。有些元素如鋅和硒具有幾種穩定性同位素,而某些微量元素如鋁、錳和鈷等只有一種穩定性同位素,因此,建立在同位素比率基礎上的穩定性同位素測定方法(質譜法)不能用來研究這些元素的吸收。另外穩定性同位素的檢測較放射性同位素更為困難,代價更高。 將同位素示蹤技術與其他的試驗方法結合起來,可更準確地研究元素的吸收、利用和影響因素。

3.1.3 原位結扎灌注技術 原位結扎灌注技術是指將動物麻醉后,打開腹腔,將試驗腸段兩端結扎,腸段中注入含有待測元素的灌注液,一段時間后,通過測定灌注液中元素的消失率、結扎腸段黏膜、血液及組織器官中元素的出現率來估計其吸收、轉運和利用。Hempe和Cousins(1989)用結扎鼠十二指腸環技術研究了螯合劑EDTA和蛋氨酸對65Zn吸收利用的影響,發現螯合物中的65Zn較氯化鋅的吸收明顯減少,鋅-EDTA以完整形式從腸腔進入黏膜細胞,但是不能通過腸道基底膜。然而,結扎腸段限制了消化產物在腸道內的流動。由于結扎腸段阻斷了小腸的蠕動,Naveh(1988)、Wapnir(1986)、Antonson(1979)等人在試驗中通過套管將結扎腸段同蠕動泵連接起來,組成一個循環系統來研究吸收、轉運和利用。Steel(1985)、Hoadley(1987)、Smith(1978,1980)等人在結扎腸段的同時,結扎腸系膜動脈和門靜脈,構成腸段、血管兩個循環系統進行試驗研究。他們指出同時結扎灌注腸管和血管,血管中的元素直接反映了元素在腸道中運輸的終點,并且血管灌注物可以不斷地帶走轉運到漿膜層的元素,所以血管流出物中的元素代表了從腸腔進入血管的單方向的流量。但是,這種方法也存在一些問題,如腸段充血和分泌過多(Smith等,1978)。Windmueller等(1977)通過持續灌輸地塞米松或去甲腎上腺素克服了上述問題。

3.2 體外法 體外法主要有4種:外翻腸囊、體外灌注腸段、小腸刷狀緣膜微粒(BrushBorder Membrane Vesicles,BBMV)和細胞培養。體外試驗的優點是:可控制試驗條件,準確度較高,干擾因素較少,所以體外試驗結果較體內試驗結果的變異小;其次,試驗時間短、成本低。但是,體外模型是處于非正常生理狀態下的,其結果能否用于說明體內情況,必須用體內試驗證實。

3.2.1 外翻腸囊 外翻腸囊技術是在體外培養腸環技術的基礎上發展而來的,即從活體取出小腸后分割成不同的片段,將各片段外翻做成囊狀物,放入培養液中培養一段時間后,取出放進裝有被測物的燒杯中,觀測腸道黏膜、漿膜及腸囊中被測物的變化(Willson和Wiseman,1954)。Seal等(1983)利用大鼠十二指腸和回腸的外翻腸囊研究有機配位體對鋅吸收的影響,認為外翻腸囊技術是研究影響鋅吸收的物質的有效手段。該方法操作簡單、快速,能詳細地觀察到元素進出腸段的變化。但該方法是在沒有血液供應的非正常生理條件下進行的,黏膜沒有營養供應,其功能未必能完全發揮,而且黏膜攝入的元素無法轉運。

3.2.2 體外灌注腸段 體外灌注腸段是指從活體取出所需要的腸段,放入充氧的培養液中,并將游離腸段與連續灌注裝置相連,通過測定培養液和腸段中的元素含量來了解其吸收和攝取情況。Sahagianc(1967)將游離腸段和一種灌注儀器連在一起,在腸段內外兩側投放不同的灌注液, 測定了鋅的吸收和轉運。Hill等(1987b)用豬和雞的體外連續灌注腸段檢測氯化鋅和蛋氨酸鋅的吸收情況,發現豬對這2種鋅源的吸收相似,雞對氯化鋅的吸收較多。2種鋅源的吸收和運輸速率可能不同,他們認為這種非外翻灌注法對腸段造成的損傷較小,可能更符合動物正常的生理狀況,但這種方法需較為復雜的儀器。

3.2.3 小腸刷狀緣膜微粒 小腸刷狀緣膜微粒技術是一種研究刷狀緣對元素攝入的方法。將所研究的腸段取出后,將黏膜輕輕刮下,經離心等一系列處理后得到刷狀緣膜微粒,通過蛋白和特殊酶活的測定來判定刷狀緣制品的純化程度。刷狀緣制品在培養液中培養一段時間后,快速過濾,通過測定濾紙上的放射性來估測刷狀緣對元素的攝入。Oestreicher(1989)用該方法制備了基底膜微粒,研究鋅在基底膜的轉運,發現該步驟可能有能量的限制。應用此技術的優點是,可以控制能量的供應,減少復雜因素,如細胞內的代謝和隔室化。

3.2.4 細胞培養 細胞培養技術是指從動物體內取出細胞,模擬體內的生理環境,在無菌、適當溫度和一定營養條件下,使細胞生存、生長并維持其結構和功能的方法。該方法具有許多優點:

1)細胞均質,類型單一,對外界影響的反應一致;

2)細胞可直接暴露在預測試劑中,能直接觀測反應,可供比較不同因素或同一因素不同劑量對同一種細胞的作用。

將細胞培養與同位素示蹤技術有機結合在國外已獲成功(Glahn,1997)。近年來,我國細胞生物學技術發展很快,使得將細胞培養用于動物營養研究成為可能。唐善虎等(1991)認為,與評定雞體鋅營養狀況常用指標比較,血細胞在體外對65Zn的攝取作為反映鋅營養狀況的指標有較好的靈敏度,且不受血漿中營養成分變化的影響。 在細胞培養模型中,Caco-2細胞系(human colon adenocarcinoma cell line)使用最多(Wienk,1999)。它自動分化,表現出小腸細胞的許多特性,包括極化、形成刷狀緣微絨毛和相關的水解酶,并且基底膜具有Na+,K+-ATP酶和激素受體(Hidalgo等,1989;Pinto等,1983)。因此,Caco-2細胞是研究微量元素在小腸的吸收和轉運的有用工具。

采用Caco-2細胞的不利之處在于:

(1)它們是人的結腸癌細胞,對于這些細胞保持正常代謝過程的程度尚不了解;

(2)缺少黏液層,而粘液層在小腸的吸收過程中起著重要作用;

(3)它們代表結腸的特性;(4)載體低表達,使得運輸速率很低。

Matsui(1999)用Caco-2細胞通道比較了氨基酸螯合鋅和硫酸鋅的吸收利用情況,發現無機鋅較有機鋅能更有效地被腸細胞吸收,但是有機鋅的轉運效率高于無機鋅,說明有機鋅和無機鋅進入了腸細胞的不同部位。已知無機鋅在腸細胞細胞質中與金屬硫蛋白形成絡合物,雖然金屬硫蛋白對鋅吸收的確切作用尚不明確,但認為這會干涉鋅在細胞內的轉運。據推測,金屬硫蛋白能束縛無機鋅,卻不能束縛有機鋅, 因此有機鋅較易被轉運。Glahn等(1996)將體外消化和Caco-2細胞培養結合起來研究食物中鐵的吸收,他認為此模型可用于篩選具有較高生物學利用率的礦物元素源。 因為內皮細胞與血漿直接接觸,并且是所有營養物質進入外周器官和組織必須通過的屏障。Bobilya(1991)用牛肺動脈內皮細胞研究了鋅的攝入和分泌模型及細胞內交換池的大小。Beutler(1998)研究了人小腸上皮細胞對氯化鋅、蛋氨酸鋅和丙酸鋅的攝取能力,未表現出明顯差異,而鋅-EDTA絡合物中的65Zn的吸收明顯減少。 盡管細胞培養技術可以很直觀地觀察細胞的反應,但人工培養環境下的細胞反應和體內細胞環境相比仍有很大差異,因此在利用培養細胞做試驗對象時,不應視為與體內細胞完全一樣,把試驗結果由體外推到體內。 綜上所述,研究元素吸收、代謝的技術多樣,所需的試驗條件各不相同,研究者可根據自身的研究目的和所具備的試驗條件來選擇適宜的試驗方法。

4 有待進一步研究的問題 因為絡合態微量元素的檢測一直是困擾各國學者的一大難題,所以目前有關有機微量元素吸收機制的研究報道很少。僅有的幾篇報道其結果也不完全一致,均與研究方法不同有關。 今后有必要探討有機微量元素中游離態和絡合態元素的檢測方法,對不同體外研究方法的結果進行比較,并通過體內方法驗證體外法研究有機微量元素的吸收和利用是否可行, 以便深入了解有機和無機元素在動物體內吸收和代謝的異同,為在畜牧業生產中科學、有效地應用微量元素添加劑提供理論依據和方法學指導。

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