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日本腦炎病毒抗體間接檢測 酶聯免疫吸附法 Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus

時間:2013-09-03 11:17:26  來源:  作者:

標準類別  NY/T 農業行業推薦標準
標準名稱  日本腦炎病毒抗體間接檢測 酶聯免疫吸附法 Indirect ELISA for antibody detection of Japanese encephalitis virus

標準分類  養殖業->檢疫方法與疾病防治
標準號  NY/T 1873—2010

頒布部門  中華人民共和國農業部

頒布日期  2010-05-20

實施日期  2010-09-01

關鍵字  日本、腦炎、病毒抗體、間接檢測、酶聯免疫、吸附法
標準內容  
1  范圍

本標準規定了日本腦炎病毒抗體的間接ELISA檢測技術操作程序。

本標準適用于進出口檢疫及流行病學調查時對豬血清中日本腦炎病毒抗體的檢測。

2  間接ELISA

2.1  材料準備

2.1.1  器材

37℃恒溫培養箱、微量移液器、震蕩混勻儀、酶標儀、酶標板等。

2.1.2  包被抗原

包被用琉原為日本腦炎病毒囊膜蛋白結構域Ⅲ重組蛋白(re-DⅢ),經大腸桿菌表達后親和層析純化而成。每孔包被量為100ng。

2.1.3  陰性對照血清

SPF豬血清,經pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(附錄A)1∶40稀釋后作為陰性對照血清。

2.1.4  陽性對照血清

日本腦炎病毒疫苗免疫健康豬,抗體中和效價達到1∶640時采血分離血清,將中和效價為1∶640的陽性血清用pH7.4的磷酸鹽緩沖液(附錄A)作1∶160稀釋,即為陽性對照血清。

2.1.5  包被液、洗滌液、封閉液、酶標抗體稀釋液、底物液、終止液

配制方法見附錄A。

2.1.6  檢測前,先將各種試劑材料平衡至室溫。

2.2  操作方法

2.2.1  抗原包被

以pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋抗原(將re-DⅢ重組抗原稀釋至1μg/mL),按每孔100μL包被酶標板,37℃作用2h后,洗滌液(PBST)洗板3次,每次5min。

2.2.2  封閉

每孔加入200μL封閉液,37℃封閉2h,洗板同上。

2.2.3  加待檢血清及對照血清

以pH7.4的磷酸鹽緩沖液作為樣本稀釋液,將待檢血清按1∶40稀釋后100μL/孔加樣,每板同時設置兩孔陰性血清對照、兩孔陽性血清對照,并設一孔空白對照。37℃作用1h,洗板同上。

2.2.4  加酶標抗體

每孔加入工作濃度的100μL兔抗豬酶標抗體,37℃作用1h,洗板同上。

2.2.5  加底物液

每孔加入底物液100μL,37℃顯色作用10min。

2.2.6  加終止液

每孔加入100μL終止液終止反應,15min之內測定OD450值。

2.2.7  結果判定

在酶標儀上讀出OD450的值。以空白值調零,計算陽性對照OD450平均值、陰性對照OD450平均值。

陰性對照OD450平均值≤0.2時試驗成立。此時,樣品OD450值與陽性對照OD450平均值比值≥0.35判為陽性;樣品OD450值與陽性對照OD450平均值比值<0.35判為陰性。

 

附錄A

(資料性附錄)

溶液的配制

A.1  包被液(碳酸鹽緩沖液,pH9.6)

NaHCO3(分析純)                        2.98g

Na2CO3(分析純)                         1.5g

定容至1000mL,混勻。

A.2  洗滌液(PBST,pH 7.4)

NaCl(分析純)                         8.0g

KH2PO4(分析純)                        0.2g

Na2HPO4·12H2O(分析純)                 2.9g

KCl(分析純)                           0.2g

Tween20(分析純)                       0.5mL

硫柳汞(分析純)                         0.1g

加雙蒸水至1000mL,調至pH7.4。

A.3  封閉液(1%BSA/PBST溶液,pH 7.4)

BSA(生物技術級)5g,加PBST至500mL。

A.4  磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)

NaCl(分析純)                          8.0g

KH2PO4(分析純)                        0.2g

Na2HPO4·12H2O(分析純)                 2.9g

KCl(分析純)                           0.2g

硫柳汞(分析純)                        0.1g

加雙蒸水至1000mL,調至pH7.4。

A.5  酶標抗體稀釋液

將小牛血清10mL加入到90mL PBST中,混勻。

A.6  底物緩沖液(TMB-過氧化氫脲溶液)

A.6.1  底物緩沖液A

TMB(生物技術級)200g,無水乙醇(或DMSO)100mL,加雙蒸水至1000mL。

A.6.2  底物緩沖液B(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L Na2HPO4緩沖液,pH 5.0~5.4)

Na2HPO4 14.60g,檸檬酸9.33g,0.75%過氧化氫尿素6.4mL,加雙蒸水至1000mL,調至pH5.0~5.4。

A.6.3  將底物緩沖液A和底物緩沖液B按1:1混合即成底物緩沖液。

A.7  底物液

TMB 1mg,1%H2O2 25μL,底物緩沖液10mL,混合即成。

A.8  終止液(2M H2SO4)

將50mL濃H2SO4緩慢滴加入300mL蒸餾水中,邊加邊攪拌,補充蒸餾水至450mL。

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